液相色譜指紋圖譜研究（昆山舒美KQ-400KDE使用）

柴胡安心膠囊為河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院的醫(yī)院制 劑( 批準(zhǔn)文號: 冀藥制字 Z20060013) ，由柴胡、葛根、白 芍、桂枝、夏枯草等 14 味藥材組方，具有疏肝理氣、鎮(zhèn) 靜安神、調(diào)和營衛(wèi)之功效，主治焦慮抑郁和心臟神經(jīng) 官能癥。有報道采用高效液相色譜( HPLC) 法測定 處方中單味藥材代表成分和建立單味藥材的指紋圖譜，柴胡安心膠囊( CHANCs) 的質(zhì)量標(biāo) 準(zhǔn)目前只 有顯微鑒別和薄層鑒別，尚未見關(guān)于其指紋圖譜研 究方面的報道。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

1200 Series 型高效液相色譜儀( 美國 Agilent 科技 有限公司) ; Sartorius BS 110S 型電子分析天平( 北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司) ; 昆山舒美KQ-400KDE 型高功率數(shù)控超聲波清洗器( 昆山市超聲儀器有限公司) ; 微孔濾膜 ( 0． 45 μm，上海興亞凈化材料廠) 。

1．2 試藥

沒食子酸對照品( 批號為 17062510) ，大豆苷對照 品 ( 批 號 為 17060913) ，肉 桂 酸 對 照 品 ( 批 號 為 20171102) ，葛根素對照品( 批號為 17072302) ，綠原酸 對照品( 批號為 17081021) ，規(guī)格均為每瓶 20 mg，均購 于上海士鋒生物科技有限公司; 蘆丁對照品( 批號為 20130809) ，槲皮素對照品( 批號為 20121205) ，規(guī)格均 為每瓶 20 mg，均購于美侖生物科技有限公司; 柴胡安心膠囊( 規(guī)格 為 每 粒 0． 5 g，批 號 分 別 為 150601，150518， 150419，150407，080115，080302，080403，20180725，編 號分別為 S1 ～ S8，河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院) 。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱: Diamonsil C18 柱( 250 mm × 4． 6 mm，5 μm) ; 流 動 相 : 0． 5% 乙 酸 水( A) － 甲 醇( B) ，梯 度 洗 脫 ，0 ～ 40 min 時 5% ～ 25% B，40 ～ 60 min 時 25% ～ 60% B， 60 ～ 80 min 時 100% B; 檢 測 波 長 : 254，275，290， 330 nm; 流速: 1 mL / min; 進(jìn)樣量: 10 μL; 柱溫: 30 ℃。 樣品(批號為 S2 )制備供試品溶液并取混合對照品 溶液，按擬訂色譜條件分別進(jìn)樣，記錄 275 nm 波長下的 色譜圖，詳見圖 1。葛根素峰與相鄰峰分離較好，峰面積 較大，理論板數(shù)不低于 300 000，故選其作為參照峰。2 h 空白溶液和供試品溶液色譜圖表明，檢測系統(tǒng)無其他峰 干擾，組分在 80 min 內(nèi)出峰完全。

 2．2 溶液制備

稱取葛根素對照品 30 mg，精密稱定，置 10 mL 容 量瓶，用甲醇定容至刻度，搖勻，得對照品溶液。分別稱 取大豆苷、沒食子酸、綠原酸、肉桂酸、蘆丁、槲皮素對照 品( 17，7，21，12，21，18 mg) ，用甲醇定容于 25 mL 容量 瓶中，作為對照品貯備液。稱取同一批樣品( 批號為 S2) 內(nèi)容物 0． 5 g，精密稱 定，加入約 50 mL 50% 乙醇回流 1． 5 h，過濾，殘渣中加 入 50 mL 50% 乙醇繼續(xù)回流 1． 5 h，重復(fù) 2 次，合并 3 次 濾液，減壓濃縮至約 15 mL，加 50% 乙醇定容至 25 mL， 搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2．3 指紋圖譜檢測波長確定

處方中的柴胡藥效成分柴胡皂苷類吸收波長約在 230 nm，白芍的芍藥苷最大吸收波長約為 254 nm，葛根 活性成分葛根素的最大吸收波長為 280 nm，夏枯草有 效成分迷迭香酸的最大吸收波長約為 320 nm。為 使該復(fù)方制劑中的主要化學(xué)成分均能顯現(xiàn)最大紫外吸 光度，盡可能地反映組方中代表成分的綜合特點(diǎn)，本研 究中利用 DAD 檢測器掃描 190 ～ 400 nm 波長信號，依 據(jù)具有藥效作用的藥材化學(xué)成分的紫外吸收光譜特征， 最終選取了 4 個特征波長( 254，275，290，330 nm) 。

2．4 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn): 精密吸取供試品溶液[取樣品(批號為 S2 )依法制備] 10 μL，連續(xù)進(jìn)樣 6 次，分別記錄 4 個檢測 波長下的色譜圖。結(jié)果以葛根素峰的保留時間和峰面積 為參照，四波長各指紋峰相對保留時間的 ＲSD 均小于 1． 00% ，相對峰面積的 ＲSD 均小于 3． 03% ( n = 6 )，表 明儀器精密度良好。 穩(wěn)定性試驗(yàn): 精密吸取供試品溶液[取樣品(批號為 S2 )依法制備]分別于 0，4，8，12，24 h 時進(jìn)樣測定，記錄 4 個檢測波長下的色譜圖。結(jié)果以葛根素峰的保留時間 和 峰 面 積 為 參 照 ，四 波 長 各 指 紋 峰 相 對 保 留 時 間 的 ＲSD 均 小 于 1． 00% ，相 對 峰 面 積 的 ＲSD 均 小 于 3． 00% ( n = 6 )，表明供試品溶液在 24 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。 重復(fù)性試驗(yàn): 取樣品(批號為 S2 )，平行制備供試品 溶液 6 份，精密吸取 10 μL 進(jìn)樣測定，分別記錄 4 個檢 測波長下的色譜圖。結(jié)果以葛根素峰的保留時間和峰面 積為參照，四波長各指紋峰相對保留時間的 ＲSD 均小 于 1． 00% ，相對峰面積的 ＲSD 均小于 2． 94% ( n = 6 )， 表明方法重復(fù)性良好。

2．5 C H A N C s 四波長指紋圖譜分析

平行四波長指紋圖譜的建立: 將 8 個批次樣品的供 試品溶液分別進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。以葛根素峰為參 照物峰，按峰出現(xiàn)率 100． 00% 計，確定各檢測波長下的 共有指紋峰，分別是 63 個( 254 nm) 、65 個( 275 nm) 、53 個( 290 nm) 、27 個( 330 nm) 。將 8 批樣品指紋圖譜信號 導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜超信息特征數(shù)字化評價系統(tǒng) 4． 0”軟件，按平均值法生成對照指紋圖譜( ＲFP) 。

3 討論

3．1 色譜條件選擇

柴胡安心膠囊主要藥材的成分如沒食子酸、大豆 苷、肉桂酸等極性差異較大，故首選梯度洗脫。試驗(yàn)過程 中，發(fā)現(xiàn)色譜圖中 4 個主成分大峰難以分開，多次更換 流動相比例和色譜柱均達(dá)不到基線分離，最后通過逐一 單位藥材按供試品溶液方法處理進(jìn)樣比對已知葛根中 相關(guān)成分極性相差較小導(dǎo)致。故參考《中國藥典》的方 法，選擇 5% ～ 25% 甲醇在 40 min 內(nèi)緩慢升高梯度，使 其相關(guān)峰得到分離。選擇流動相時，發(fā)現(xiàn)沒食子酸和大 豆苷的色譜圖拖尾嚴(yán)重，選擇了不同體積分?jǐn)?shù)的醋酸溶 液，發(fā)現(xiàn)隨著醋酸比例的升高，上述成分的峰形逐漸對 稱，進(jìn)而達(dá)到測定要求

3．2 平行指紋圖譜技術(shù)的均值法評價

利用任意的單個波長均不能完整地表達(dá)制劑中不 同種類化學(xué)成分的全部指紋信息，因此選擇單味藥材中 具有藥效作用的主要成分下的特征波長，對不同波長下 色譜圖進(jìn)一步整合，得到復(fù)方制劑的多維信息，才能最 終鑒別其真實(shí)質(zhì)量。本試驗(yàn)中分別采用獨(dú)立權(quán)重法、均 值法和投影參數(shù)法、信息熵權(quán)重法整合各批次樣 品在 4 個特征波長下的定性、定量指紋圖譜信息，以系 統(tǒng)指紋定量法評價質(zhì)量，發(fā)現(xiàn) 8 個批次的樣品質(zhì)量等級 基本一致。結(jié)合均值法簡單便捷的特點(diǎn)，最終選擇其作 為整合指紋整體信息的方法。

 

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