超聲波提取法對抑菌活性的篩選

植物源農(nóng)藥的主要成分來源于自然，具有選擇性高、低毒、易降解，害物不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點，從 植物中尋找抑菌活性物質(zhì)，是研發(fā)新型殺菌劑的熱點之一?，庒t(yī)藥是瑤族人民長期與疾病作斗爭的智慧 結(jié)晶，104 味經(jīng)典老班藥中，很多是治療細菌感染的藥物，這為新型抑菌活性物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)提供了線索。事 實上，雖然國內(nèi)外對具農(nóng)藥活性植物的篩選一直沒有停止，但針對瑤藥的農(nóng)用活性篩選卻少見報道。本 研究對我國部分瑤藥植物的甲醇提取物進行抑菌活性的篩選，旨在篩選出具有較高活性抑菌植物，為開 發(fā)新型植物源農(nóng)藥奠定基礎(chǔ)。

煙草青枯菌( Ｒalstonia solanacearum) 和蠟狀芽孢桿菌( Bacillus cereus) 由西北農(nóng)林科技大學無 公害農(nóng)藥研究服務中心提供; 金黃色葡萄球菌 ( Staphylococcus aureus) 標準菌株為金黃色葡萄球菌 ATCC25923 購買自廣東省微生物菌種保藏中心。供試瑤藥購買自廣西省南寧市大福子原生草藥店，并由 西北農(nóng)林科技大學生命學院李琰副教授鑒定。31 種瑤藥及其科屬見表 1。分析純甲醇和分析純 DMSO 購自四川西隴化工有限公司; 電子天平，ALC-1100． 2，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司; 旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)儀， Ｒ205B 型，上海申生科技有限公司; 超聲波清洗器，KQ-250B，昆山市超聲儀器生產(chǎn)公司; 循環(huán)水式多用真 空泵，SHB-B95A 型，鄭州長城科工貿(mào)易有限公司。

采用超聲波提取法將陰干的植物材料在 40 ℃ 下烘干，粉碎后過 40 目篩，放入自 封袋中。試驗前稱取 50 g 的植物干粉，加入甲醇進行超聲波提取，每次 60 min，重復提取 3 次。過濾后濃 縮，保存于 4 ℃冰箱內(nèi)待用。

室內(nèi)生測用于活化細菌性病原菌菌株的液體培養(yǎng)液( LB 培養(yǎng)基) : 稱取胰蛋白 胨 10 g、酵母粉 5 g、氯化鈉 3 g，加水定容至 1 L，滅菌鍋滅菌待用。

采用對供試病菌沒有抑菌作用的二甲基亞砜作為溶劑，將供試瑤藥提取物溶解。用二甲 基亞砜 － 水溶液將各瑤藥提取物按其有效成分含量溶解稀釋成 1 000 mg·L － 1 藥液 ( 作為母液備用) 。

將供試菌種在試驗前 1 d 轉(zhuǎn)接到 LB 培養(yǎng)液中，置于 28℃恒溫搖床箱中活化 12 h。

采用二倍稀釋法對瑤藥提取物進行室內(nèi)抑菌 活性篩選和最低抑菌濃度( MIC) 測定。測定方法:

( 1) 室內(nèi)抑菌活性篩選方法: 實驗操作在 96 孔板上 進行，每孔加入 50 μL 稀釋后細菌數(shù)量達 104 cfu·mL － 1 的供試菌菌懸液與 50 μL 質(zhì)量濃度為 1 000 mg· L － 1 藥液，使藥液最終濃度為 500 mg·L － 1 ，培養(yǎng) 24 h 后觀察結(jié)果; 再進一步將母液稀釋為 200 mg·L － 1 藥 液，實驗操作方法同上，使藥液最終濃度為 100 mg·L － 1 ，培養(yǎng) 24 h 后觀察結(jié)果;

( 2) 最低抑菌濃度( MIC) 測定方法: 取編號為 1 ～ 5 的試管以及適量的蒸餾水，放入滅菌鍋里滅菌待用。滅菌完成后，除 1 號試管加 入 4 mL 無菌水外，其余試管均加入 2 mL 無菌水。將 1 mL 配制好的質(zhì)量濃度為 1 000 mg·L － 1 的母液加 入 1 號試管中，混合均勻后，將混合后的藥液取 2 mL 加入到 2 號試管中，以此操作至 5 號試管為止。使藥 液濃度稀釋為 200，100，50 ，25，12． 5 mg·L － 1 共 5 個濃度。在 96 孔板上每孔加入 50 μL 稀釋后細菌數(shù)量 達 104 cfu·mL － 1 的供試菌菌懸液與 50 μL 藥液，使藥液最終濃度為 100，50，25，12． 5，6． 25 mg·L － 1 ，以硫 酸鏈霉素作為對照藥劑。培養(yǎng) 24 h 后，通過肉眼比對發(fā)現(xiàn)微孔內(nèi)液體澄清透明經(jīng)震蕩后仍無沉淀產(chǎn)生， 則此微孔對應的藥液濃度即為此提取物對待測病菌的 MIC 值。

采用二倍稀釋法在 500，100 mg·L － 1 的濃度 下，測定了 31 種瑤藥植物的甲醇提取物對煙草青枯菌的抑菌活性實驗，結(jié)果表明: 在 500 mg·L － 1 的濃度 下有 18 種瑤藥提取物表現(xiàn)出顯著的抑菌活性，在 100 mg·L － 1 的質(zhì)量濃度下有 3 種瑤藥提取物表現(xiàn)出顯 著的抑菌活性( 表 1) 。

采用二倍稀釋法對穿破石、獨腳風、貫眾等 3 種瑤藥 提取物進行最低抑菌濃度測定。結(jié)果表明: 3 種瑤藥提取物對煙草青枯菌、蠟狀芽孢桿菌和金黃色 葡萄球菌均有顯著的抑制效果。3 種瑤藥提取物對煙草青枯菌的 MIC 分別為 25，25，25 μg·mL － 1 ，對蠟 狀芽孢桿菌的 MIC 分別為 12． 5，50，50 mg·L － 1 ，對金黃色葡萄球菌的 MIC 分別為 50，25，50 mg·L － 1 。

我國對具農(nóng)藥活性植物的篩選，一般是參考《本草綱目》等古籍和《中國土農(nóng)藥志》《中國有毒植物》 等專著及在生產(chǎn)中人們使用的土農(nóng)藥。前期，國內(nèi)多位學者對我國陜、甘、青、新、寧、蘇、粵、桂、鄂、閩、 川、黔等地區(qū)的 2 000 多種野生植物或中草藥進行了農(nóng)用活性的篩選，發(fā)現(xiàn)了砂地柏、牛心樸子、掌葉千里 光、辛夷、廣陳皮、博落回等多種植物具有較好的殺蟲活性; 茄科、百部科、藜科、馬錢科、豆科、菊科、仙茅 科、玄參科、蕓香科、天南星科、姜科、唇形科、菊科、桔梗科、忍冬科、傘形科、蓼科、大戟科等植物的殺蟲活 性值得深入研究; 豆科、禾本科、菊科、傘形科、十字花科、馬兜鈴科、唇形科、葫蘆科、蓼科、木蘭科、百合 科、木犀科、莎草科和樟科等植物的殺菌活性具開發(fā)應用前景。近 10 余年來，國內(nèi)學者篩選的范圍進一 步擴大，同時更加注重對植物源物質(zhì)特殊生物活性的發(fā)現(xiàn)。



 

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