舒美超聲清洗器在抗血栓活性部位篩選中的應用

從活血化瘀類中藥中發現抗血栓活性顯著的 先導化合物已成為新藥研發的一個重要途徑，也成 為當下藥物研究工作者關注的重點問題。三棱為 黑三棱科植物黑三棱的 干燥塊莖，屬于破血逐瘀類中藥，具有破血行氣、消 積止痛等功能，臨床常以其炮制品醋三棱入藥治療 血瘀證。近代中西醫結合奠基人張錫純亦極為推 崇三棱，譽之為“化瘀血之要藥”，常與莪術配伍，有“三棱長于破血，莪術長于破氣”之說。現代研究 發現，三棱能抗血小板活化和聚集，在抑制血栓形 成過程中發揮重要作用。

RＥ－５２ＡＡ旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；ＳＨＺ－Ⅲ減壓抽濾泵（上海知信實驗儀器技術 有限公司）；４２０型恒溫水箱（江蘇金壇市中大儀器 廠）；ＫＱ－２５０Ｅ 型醫用超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ＦＡ１１００型電子分析天平（上海精密科學儀器有限公司）；ＭＥＴＴＬＥＲ ＡＥ２４０型電子 分析天 平 （瑞 士 梅 特 勒 公 司）；ＰＨＳ２－３Ｃ 型 精 密 ｐＨ 計（上海雷磁儀器廠）；ＨＰＧ－２８０ＢＸ 型光照培 養箱（哈爾濱市東聯電子技術開發公司）；倒置熒光 顯微鏡（ＯｌｙｍｐｕｓＩＸ５３）；ＢＳ－２００全自動生化分析 儀（深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司）；ＡＣＳ－６ 型電子秤（山東濟南風華電子衡器有限公司） ＤＭＳＯ（上海生工生物工程股份有限公司，批號 ＢＢ０２ＢＡ０００１）；阿司匹林（ＳＩＧＭＡ，批號 ＭＫＣＤ０９５７）， 花生四烯酸（上海梯希愛化成工業發展有限公司，批 號 ３ＡＸＺＩ－ＳＢ）；鄰 聯 茴 香 胺 （ＳＩＧＭＡ，批 號 ＭＫＣＣ７５０１）；純水（杭州娃哈哈集團有限公司）。三 棱藥材購自安徽亳州隆泰藥業有限公司（產地：廣西， 批號２０１５０４０１），經山東中醫藥大學張兆旺教授鑒定 為黑三棱科植物黑三棱的干燥塊莖，符合２０１５年版 《中國藥典》一部三棱項下規定。 斑馬魚為 ＡＢ 系３ｄｐｆ（Ｄａｙｓｐｏｓｔｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ， 受精后的天數）野生型健康斑馬魚，購于國家斑馬 魚養殖中心，養殖于山東省科學院生物研究所。涉 及的動物實驗經山東省中醫藥研究院動物倫理委 員會批準，批準號２０１７００３。

取醋三棱藥材１０ｇ，粉碎至粗 粉，用８０％乙醇浸提２次，合并提取液，減壓濃縮得 總提取物浸膏２４０．９ｍｇ。將浸膏懸浮于水中依次 用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進行萃取，減壓回收溶 劑。得到石油醚萃取物３７．６ｍｇ，乙酸乙酯萃取物 ４３．５ｍｇ，正丁醇萃取物７８．５ｍｇ，以及剩余水溶性部分５４．８ｍｇ。４ ℃冰箱保存備用。

正常的３ｄｐｆＡＢ系斑馬魚，隨機數字表法分于２４孔 板中，每孔板中放置１１條，設置６個實驗組：即空 白對照組、血栓模型組（用１００μｍｏｌ·Ｌ－１花生四烯 酸處理１ｈ）、陽性對照組（用２２．５μｍｏｌ·Ｌ－１阿司匹 林培養６ｈ后，再加入１００μｍｏｌ·Ｌ－１花生四烯酸共 處理１ｈ）、實驗藥物組（總提取 物、石 油 醚 萃 取 部 位、乙酸乙酯萃取部位、正丁醇萃取部位和水部位， 根據預實驗確定濃度提取 物 最 終 濃 度 為 １００，７５， ５０，２５，１０μｇ·ｍＬ－１）培養６ｈ后，再加入１００μｍｏｌ· Ｌ－１花生四烯酸共處理１ｈ。

每組隨機數字表法挑選１０尾斑 馬魚，用鄰聯茴香胺染色液（精密稱取鄰聯茴香胺 ３５．７３ｍｇ、醋 酸 鈉 ８５．０５ ｍｇ，置 ５０ ｍＬ 量 瓶 中，加 ３０％過氧化氫溶液２．５ｍＬ，再用５０％乙醇定容，搖 勻）染色，在熒光顯微鏡下觀察染色情況并拍照記錄， 照片拍攝放大倍數為５０倍。用 ｍａｇｅ－ＰｒｏＰｌｕｓ５．１軟 件定量分析斑馬魚心臟紅細胞染色強度（ＳＩ），并計算 預防血栓 藥 效（％）＝［ＳＩ（藥 物 干 預 組）－ＳＩ（模 型 組）］／ＳＩ（正常組）－ＳＩ（模型組）×１００％。

實驗數據以ｘ±ｓ表示，均數 比較采用單因素方差分析（Ｏｎｅ－ＷａｙＡＮＯＶＡ），所 有統計學處理均由ＳＰＳＳ２０．０軟件統計完成。Ｐ＜ ０．０５表示差異有顯著性。

分 離 取 “２．１．１”項下乙酸乙酯部位用１．５倍的硅膠拌樣，依 次用丙酮－甲醇（１５∶１～１∶１）進行梯度洗脫，洗脫液 經硅膠薄層鑒別后，合并組成相似的流分，對 Ｆｒｃ．２ 和 Ｆｒｃ．３再進行反復硅膠、ＯＤＳ柱色譜和半制備色 譜純化，最終得到化合物１～１１。

三棱抗血栓形成活性部位的篩選 花生四烯 酸誘導構建斑馬魚血栓模型并進行三棱抗血栓活 性部位的篩選，檢測結果表明三棱提取物的４個萃 取部位中，乙酸乙酯部位對斑馬魚血栓模型心臟紅 細胞染色強度顯著增加（Ｐ＜０．０１），具有顯著抑制 血栓形成的作用，正丁醇部位次之，石油醚部位作用最弱。

網絡藥理學是近年來單靶點藥物研究的基礎 上發展起來的一門新興學科，不僅集成了系統生物 學、網絡生物學與化學生物學等學科，而且還整合 了計算預測與實驗驗證等研究方法，已逐漸成為現 代醫藥研究中的前沿交叉學科，其所強調的整體性 與系統性和中醫藥理論不謀而合，更加適合中醫藥 的學術特點和實際，能夠很好的指導藥效物質的尋 找等。本課題組前期基于網絡藥理學方法，通過 中藥整合藥理學平臺（ＴＣＭ－ＩＰ）分析三棱的抗血栓 形成及抗血小板聚集分子機制，發現中樞神經“下 丘腦－垂體”系統在三棱發揮抗血栓形成和抗血小板 聚集過程中發揮了十分重要的作用。因此，本研 究采用斑馬魚血栓模型作為三棱活性部位篩選的 藥理模型，其作為一種整體模式生物，具有保守的 神經系統 構 造，可 以 模 擬 中 樞 神 經 系 統 的 調 控 作 用，相比體外細胞模型，更有利于全面反映中藥三 棱藥效物質的作用機制。