易混淆品HPLC鑒別

維吾爾藥烏斯乃為松蘿科松蘿屬植物節(jié)松蘿 Usnea diffracta Vain． 的干燥全草，性平和，具有收斂營養(yǎng)力、消散 淤結(jié)、爽身強(qiáng)心、調(diào)經(jīng)助陽的功效，用于久瀉、久咳、心 悸氣短、癲癇、神失、心煩陽弱、嘔惡氣喘、月事不調(diào)、 毒蛇咬傷。前期課題組在市場調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，烏斯乃使用 的藥材各異，來源復(fù)雜，作為 《中華人民共和國衛(wèi)生部藥 品標(biāo)準(zhǔn) 維吾爾藥分冊》收載品種，標(biāo)準(zhǔn)中僅有 “理化鑒 別”項，難以判斷藥材的真?zhèn)危ＷC其入藥的準(zhǔn)確性及 臨床的有效性。 本研究對烏斯乃的市場流通及臨床應(yīng)用情況進(jìn)行調(diào)查， 并建立烏斯乃及其替代品、易混淆品的 HPLC 鑒別方法。 該方法快速、簡便、專屬性強(qiáng)，可為該藥材的準(zhǔn)確、安全 使用及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供數(shù)據(jù)支持。

烏斯乃及其替代品、易混淆品 ( 圖 1) 收集于新疆和 田維吾爾市場、甘肅藥材市場，經(jīng)中國科學(xué)院微生物研究 所真菌學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗室郭守玉研究員鑒定，憑證標(biāo)本存 放于新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所。 松蘿酸、黑茶漬素為實(shí)驗室自制 ( 結(jié) 構(gòu) 經(jīng)1 H-NMＲ、 13 C-NMＲ、MS 等波譜技術(shù)鑒定) ，HPLC 法測定其含有量均 大于 99%。微孔濾膜 ( 0. 22 μm，天津市津騰實(shí)驗設(shè)備有 限公司) 。HPLC 所用試劑均為色譜純; 水為超純水。 Waters2695 高效液相色譜儀 ( 美 國 Waters 公 司) ; PDA2998 檢測器 ( 美國 Waters 公司) ; Shimpack PＲEP-ODS ( HKIT) C18色譜柱 ( 250 mm×4. 6 mm，5 μm，日本島津公 司) ; 電子天平(德國賽多利斯天平) ; KQ5200DB 超聲波清洗器 ( 昆山市超聲儀器有限公司) 。

走訪調(diào)查，以及對資深專業(yè) 人士的訪談。

Shimpack PＲEP-ODS ( HKIT) C18色譜柱 ( 250 mm× 4. 6 mm，5 μm) ; 流 動 相 甲 醇-1% 乙 酸 ( 79 ∶ 21) ; 柱溫 30 ℃; 檢測波長 285 nm; 體積流量 1. 0 mL/min; 進(jìn)樣量 10 μL。

取樣品約 0. 1 g，精密稱定，置 于具塞錐形瓶中，精密加入乙酸乙酯 50 mL，密塞，稱定 質(zhì)量，超聲 ( 200 W、40 kHz) 提取 40 min，取出，放冷， 再稱定質(zhì)量，乙酸乙酯補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取 續(xù)濾液，即得。

精密吸取各供試品溶液 10 μL， 注入高效液相色譜儀，在 “2. 2. 1” 項色譜條件下進(jìn)樣。 對不同供試品 HPLC 色譜圖的峰數(shù)、峰面積、相對保留時 間等參數(shù)進(jìn)行比較，優(yōu)化圖譜。

將樣品色譜圖導(dǎo)入 “中藥色譜指紋圖譜 相似度評價系統(tǒng) ( 2004 年 A 版) ”軟件，分析相似度。

課題組對各地維吾爾藥材 市場及維吾爾醫(yī)院的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，烏斯乃替代品、易混淆品 常見的有梅衣屬植物槽梅衣 Parmelia sulcata，條衣屬植物 條衣 Everniastrum cirrhatum、中華金絲 Lethariella sinensis 和 長松蘿 Usnea longissima。

隸屬于梅衣科梅衣屬地衣，葉狀，上表 面礦灰色，有光澤，下表面黑色，具有假根，致密，富分 枝; 髓白色; 分生孢子器不發(fā)達(dá); 子囊盤表面生，罕見。 主要生長在巖石或樹皮上，分布于新疆等地。

3. 1. 2 條衣

隸屬于梅衣科條衣屬葉狀地衣，上表面淺 灰至灰色，下表面黑色; 裂片邊緣整齊，稍向內(nèi)卷，有時 成溝狀，裂片深裂成條帶狀，形成二叉狀分枝，髓白色， 邊緣常有纖毛或假根。主要生長在松樹或其他灌木的枯枝 上，分布于云南、河北等地。

梅衣科金絲屬地衣，具有真菌和藻類 共生形成的特殊復(fù)合生物，多年生，枯草黃至黃綠色; 絲 體呈圓柱形或扁圓形，絲狀體表面呈網(wǎng)狀棱脊，基部污白 色，向上漸次赭黃或桔黃色，無光澤，稍卷曲，頂端漸尖， 無粉芽，子囊盤及分生孢子器。主要生長在高海拔雪山地 帶的松樹枯枝上，分布于西藏、云南、四川等地。

松蘿科松蘿屬枝狀地衣，灰綠色，成 線狀，下垂，長可達(dá) 100 cm。外皮粗松，中心堅密。子器 稀少，皿狀，生于枝的先端。主要生長在松樹或其他樹的 樹皮上，分布于東北、陜西、安徽、浙江、廣東、云南、 西藏等地。

精密吸取空白溶液 10 μL，注入高效 液相色譜儀，結(jié)果表明空白不干擾測定。

同一供試品溶液在 “2. 2. 1”項色 譜條件下連續(xù)進(jìn)樣 7 次，測得主要色譜峰面積及保留時間 ＲSD 為 0. 30%，表明儀器精密度良好。

取同批藥材 6 份，按 “2. 2. 2”項 下方法制備供試品溶液，在 “2. 2. 1”項色譜條件下進(jìn)樣， 測得主要色譜峰面積及保留時間 ＲSD 為 0. 96%，表明該方 法重復(fù)性良好。

取同一供試品溶液，分別于 0、1、2、4、6、12、24 h 在 “2. 2. 1”項色譜條件下進(jìn)樣，測得 主要色譜峰面積及保留時間 ＲSD 為 0. 47%，表明供試品溶 液在 24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

烏斯乃及其替代品、易混淆 品的 HPLC 圖譜見圖 2，包括色譜峰數(shù)、相對保留時間、色 譜峰峰面積及比例，可直觀地發(fā)現(xiàn)烏斯乃及其替代品、易 混淆品上述指標(biāo)差異很大。以烏斯乃正品為對照，利用相 似度軟件進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)替代品、易混淆品與其相似度很 低，條 衣、中 華 金 絲、槽 梅 衣、長 松 蘿 分 別 為 0. 003、 0. 004、0. 003、0. 001。 由 HPLC 色譜圖可知，在 30 min 內(nèi)條衣有 16 個特征色 譜峰，其 中 易 于 辨 識 的 有 9 個， 最具特征性的在 11. 263 min處，峰形大; 中華金絲有 7 個分離度較好的色 譜 峰，18. 620、24. 068 min 處 為 其 特 征 峰，黑 茶 漬 素 ( 24. 068 min) 所占比例為 59. 90%; 烏斯乃有 10 個色譜 峰，13. 301、19. 376、21. 669 min 處為其特征峰，且三者 含有量達(dá) 90%; 槽梅衣有 9 個特征峰，主要集中于11 min 前，其中 5. 208 min 處所占比例達(dá) 80%; 長松蘿有 9 個特 征峰，以 10. 934、18. 950 min ( 松 蘿 酸) 為 主，兩 者 占 99. 75%。 4 討論與結(jié)論 課題組在甘肅、新疆、四川、東北等地的調(diào)查發(fā)現(xiàn)， 烏斯乃野生資源非常少，僅在黑龍江紅星林場中生長，蘊(yùn) 藏量極低。目前，藥材市場上未見有節(jié)松蘿出售，現(xiàn)新疆 維吾爾醫(yī)院及藥材市場用的烏斯乃主要是槽梅衣和條衣。 據(jù) 《中華本草》 ( 維吾爾藥卷) 記載，長松蘿也是烏斯乃 藥材的來源之一，隨著用藥的規(guī)范化，新疆維吾爾藥廠現(xiàn) 在用的基本為該品種。中華金絲由于形態(tài)和節(jié)松蘿有諸多

的相似之處，一直誤作為節(jié)松蘿使用和出售，基于此，課 題組發(fā)現(xiàn)烏斯乃用藥問題存在相當(dāng)長一段時間，直接影響 了藥物有效性和臨床安全性，對于這些藥物是否可以代替 烏斯乃入藥還需要進(jìn)一步的證實(shí)。

烏斯乃常見替代品、易混淆品為梅衣屬、松蘿屬植物， 松蘿屬植物以縮酚類、二苯并呋喃類、蒽醌類等成分為主， 但是均含有松蘿酸; 梅衣屬植物主要含有黑茶漬素、藻 紋苔酸、protocetraric 等成分; 條衣屬植物含有生物堿、 皂苷、鞣質(zhì)類。金絲屬植物主要含有一些色素類物質(zhì)( canarione、1，2-quinone derivatives、rubrocashmeriquinone、 7-chlororubrocashmeriquinone、7-chlorocanarione ) 。 由 此 可 見，烏斯乃與其替代品、易混淆品化學(xué)成分的差異較大， 因此可用 HPLC 法進(jìn)行鑒別。

本實(shí)驗建立了烏斯乃 HPLC 圖譜，與市場上常用的替 代品、混淆品相比，其共有峰數(shù)差異明顯，表明化學(xué)成分 存在較大區(qū)別，它們能否應(yīng)用于臨床還需進(jìn)一步研究。

同時，該方法基線穩(wěn)定，易于操作，重復(fù)性好，能有 效地區(qū)分烏斯乃及其替代品、易混淆品，可為該藥材的鑒 別及質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。