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當前，海洋環(huán)境污染日趨嚴重，赤潮現象頻頻發(fā)生。由赤潮生物暴發(fā)所產生的大量生物毒素通過食 物鏈進入人體，進而威脅人類健康。軟骨藻酸( Domoic acid，DA) 是一種具有神經毒性的氨基酸類化 合物，是記憶喪失性貝毒的主要成分，主要由海洋硅藻-擬菱形藻( Pseudo-nitzschia) 產生。DA 能夠引 起海洋哺乳動物及人類中毒，甚至死亡。鑒于其對人類健康存在的潛在威脅，國際食品法典委員 會( CAC) 規(guī)定貝類中 DA 的安全限量為 20．0 μg /g ，美國、加拿大、歐盟、日本和中國等國家相繼執(zhí)行 此國際標準。
近年來，有害擬菱形藻及其產生的 DA 在全球海域的分布范圍逐漸擴大。本格拉上升流海域 檢測到 DA 的最高濃度達 180 ng /L ; 在法國北海海域近岸海水中 DA 濃度在 102～263 ng /L 之間。 2015 年 5～8 月在美國北部西海岸暴發(fā)的一次大規(guī)模產毒擬菱形藻藻華事件，造成大量海豚、海獅及海 鳥死亡，在該海域螃蟹等海產品中檢出高濃度 DA，已超出其安全限量范圍; 2017 年中國近海發(fā)現能 夠產生 DA 的擬菱形藻，南海海域多個批次海產品中也檢出 DA，在扇貝中的累積量高達 10．1 μg / g 。DA 對海產養(yǎng)殖業(yè)帶來了嚴重威脅，因此需對 DA 進行有效檢測與監(jiān)測。目前，DA 的檢測方法主 要有生物分析法、高效液相色譜法、熒光檢測法、質譜法、酶聯免疫分析法和毛細管電泳 法等。其中，高效液相色譜法及高效液相色譜-質譜聯用技術具有準確性高、穩(wěn)定性好的特點，是目 前測定 DA 的最佳方法。海水是海洋養(yǎng)殖生物的棲息地，海水中毒素的濃度水平直接影響海產品的食 用安全，而對海洋養(yǎng)殖環(huán)境水體中毒素的有效檢測是海產養(yǎng)殖安全管理的前提。由于海水中 DA 含量 較低，且 DA 是一種極性較大的親水性物質，對高鹽海水基質中的 DA 直接進行儀器檢測和快速富集比 較困難。無定型 TiO2 、分子印跡聚合物、磁性材料等常被用作吸附劑，對海水中的 DA 進行分 離富集，然而這些吸附材料還未實現產業(yè)化生產，無法進行廣泛推廣應用。采用商品化C18固相萃取柱可實現海水中 DA 的富集，但富集倍數僅 20 倍; 利用商品化的反相 C18固相萃取膜盤對海水中的 DA 進行富集時，富集倍數為 20 倍，回收率達 90．0%以上，然而通過增加海水上樣量提高富集倍數時，方法 的回收率明顯下降，說明該方法富集倍數和效率低，不適于海水中痕量 DA 的高效富集。因此，急需 開發(fā)對海水中痕量 DA 分離效果好、富集倍數高，并且能夠推廣應用的新富集方法。
固相萃取膜盤技術由于具有盤片上吸附劑分布均勻、超低溶出及動力學高效率( 高流速不會影響 回收率) 的特點，在大體積水樣處理中具有傳統(tǒng) SPE 小柱無法比擬的優(yōu)勢，已成為環(huán)境水體微量污染物 快速富集、凈化的高效方法。本研究采用磺化苯乙烯-乙烯基苯( SDB-ＲPS) 共聚物材質且對極性 化合物有高效吸附性的固相萃取膜盤，結合高效液相色譜-紫外檢測/質譜分析法，建立了一種針對海水 中痕量 DA 進行高效富集測定的新方法，并將其應用于東海海域海水樣品中 DA 的測定。
1220 型高效液相色譜儀、6320 型電噴霧離子阱質譜儀( 美國 Agilent 公司) ;電子天平 ( 賽多利斯) ; Milli-Q 超純水處理系統(tǒng)( 美國 Millipore 公司) ; KQ-400KDE 型高功率數控超 聲波儀( 昆山市超聲儀器有限公司) ; ＲE100-pro 旋轉蒸發(fā)儀( 北京大龍公司) ; 磺化苯乙烯-乙烯基苯 ( SDB-ＲPS) 固相萃取膜盤、C18固相萃取膜盤( 47 mm，美國 3M 公司) ; 5 TC-C18( 2) 色譜柱( 150 mm× 4．6 mm) 、Poroshell 120 色譜柱( 100 mm × 3． 0 mm) 、ZOＲBAX 300 SB-C18 色譜柱( 150 mm × 3． 0 mm， 3．5 μm) 均購于美國 Agilent 公司; 0．22 μm 混合纖維膜( 上海市新亞凈化器件廠) 。 甲酸( 色譜純) 、乙酸銨( 優(yōu)級純) ( 瑞士 Fluka 公司) ; 甲醇、乙腈( 色譜純，美國 TEDIA 公司) ; 丙 酮、異丙醇( 色譜純，德國 Merck 公司) ; DA 標準品( 美國 Sigma 公司) ; 實驗用水為 Milli-Q 超純水 ( 18．2 MΩ cm) 。
色譜條 件: Agilent 5 TC-C18 ( 2) ( 150 mm × 4． 6 mm，5． 0 μm) 色 譜 柱，90． 0% ( V /V) 乙 腈 ( 含 2．0 mmol /L 乙酸銨+0．1%甲酸) 為流動相，等度洗脫，柱溫 35℃，流速 1．2 mL /min，二極管陣列檢測器 ( DAD) 檢測波長 242 nm，進樣量 20．0 μL。與質譜聯用分析時，由 HPLC 流出進行分流，使得進入質譜 的流動相流速為 0．3 mL /min。 質譜條件: 電噴霧正離子模式檢測，全掃描范圍為 m /z 100 ～ 500，干燥氣溫度 350℃，干燥氣流速 10．0 L /min，噴霧氣壓力 206．8 kPa。二級質譜分析選擇 DA 的母離子為［M+H］+ ( m /z 312．2) ，生成特征 碎片離子 m /z 266．2、294．2、248．2。
取 2．0 L 海水樣品，經孔徑為 0．22 μm 的濾膜過濾去除懸浮顆粒物，加入 8．0 mL 甲酸進行酸化處 理，然后進行固相萃取膜盤富集。首先對 SDB-ＲPS 固相萃取膜盤進行活化處理: 加入 10．0 mL 丙酮，使 丙酮溶液通過膜片浸泡 30 s，抽干; 加入 10．0 mL 異丙醇，使異丙醇溶液通過膜片浸泡 30 s，抽干; 加入 10．0 mL 甲醇，待甲醇溶液只剩約 1．0 mL 時，加入 10．0 mL 水，待膜片上保留約 1．0 mL 水時，固相萃取膜 盤完成活化。取酸化后的海水樣品，以 6．0 mL /min 的流速過固相萃取膜盤，加入 20．0 mL 水對膜盤進 行淋洗，抽干; 使用 20．0 mL 80．0%( V /V) 甲醇分 2 次對 DA 進行洗脫，合并洗脫液，采用旋轉蒸發(fā)儀在 50℃下將洗脫液進濃縮至干，用 1．0 mL 乙腈-水( 1∶ 19，V /V) 復溶，轉移到進樣小瓶中，待測。
由文獻可知，DA 有較強的紫外吸收，為了能獲得較高的靈敏度，在 210 ～ 400 nm 范圍內進 行掃描。由 DA 的紫外吸收光譜圖( 圖 1A) 可見，DA 的最大吸收峰在 242 nm 處，因此選擇 242 nm 作為 DA 的最佳檢測波長，這與文獻結果一致。反相 C18色譜柱常用于 DA 的 HPLC 分離分析; 考 慮到 DA 是一種極性較大的弱酸性化合物，在反相 C18色譜柱上保留較弱，本研究以水-乙腈混合液為流動相，對 3 根同一廠家不同碳載量的 C18色譜柱( 5TC-C18( 2) 、Poroshell 120、ZOＲBAX 300 SB-C18色譜柱) 進行 了比較，結果表明，Agilent 5 TC-C18( 2) 色譜柱的分離效果最理想，分離度高，并且峰形尖銳對稱，說明不 同的色譜柱對海水中的 DA 分離結果差異較大，選擇碳載量相對較低的 C18柱尤為關鍵。在最佳色譜分離 檢測條件下，對添加 DA 標準品的海水樣品進行了分析，色譜圖如圖 1B 所示，DA 色譜峰尖銳對稱，與海 水中的干擾組分達到了良好分離，可以準確積分其峰面積，進而對海水中 DA 進行定量測定。
建立了一種基于固相萃取膜盤富集的高效液相色譜-紫外檢測/質譜測定海水中溶解態(tài) DA 的新方 法。與傳統(tǒng)的固相萃取小柱法相比，固相萃取膜盤法的海水樣品上樣速度快、富集倍數高、不易堵塞，適 于在調查船對海水中微量 DA 的現場快速富集。利用 SDB-ＲPS 固相萃取膜盤對 2．0 L 海水中微量 DA 進行快速富集，富集倍數高達 2000 倍，方法回收率和重復性良好，使常規(guī)高效液相色譜-紫外檢測法達 到了測定實際海洋環(huán)境水體中 DA 的靈敏度要求。本研究也為大體積遠洋環(huán)境水體或極地海水中痕量 有機物現場快速富集方法的建立提供了新思路，為解決海水樣品體積大、不易在調查船上長期冷凍保存 和運輸的難題提供了新方法。
