不同途徑給藥的大鼠體內藥動學研究-KQ-200VDE使用

包蟲病是棘球絳蟲的幼蟲于人體內所致的一種嚴重的人獸共患寄生蟲病，有“寄生蟲腫瘤”之稱， 新疆為高發區。現階段以外科手術治療為首選， 但術中易播散，復發率較高。藥物治療因能降低復 發率、提高手術治愈率而不斷得到肯定。

材料與方法

1 藥品與試劑

DH-004( 新疆華世丹藥業股份有限公司，批號: 171213，純度≥95% ) ; 替硝唑對照品( 中國食品藥 品檢定研究院，批號: 100336-201704，純度 ＞ 98% ) ; 無水甲 酸 ( 天津市光復精細化工研究所，批 號: 20110527，色譜純) ; 乙醚( 天津市富宇精細化工有 限公司，批號: 20130516，分析純) ; 甲醇( 美國 Sigma 公司，批號: 155809，色譜純) ; 乙腈( 美國 Fisher 公 司，批號: 150941，色譜純) ; 水為超純水。

2 儀器

Acquity H-Class UPLC( 美國 Waters 公司) ; QDA 單重四級桿質譜檢測器 ( 美 國 Waters 公 司) ; NM32LA 氮氣發生器( 英國 Peak 公司) ; FJY 1002 UVF 基因研究型超純水機( 青島富勒姆科技有限公 司) ; BP211D 電子天平( 德國 Sartorius 公司) ; KQ 200VDE 雙頻數控超聲波清洗器( 昆山市超聲儀器有限公司) ; IKA MS3 數顯型渦旋振蕩器( 德國 Ika 公司) ; HC 2518 高速冷凍離心機( 安徽中科中佳科學儀器有限公司) ; BYN100 1 氮吹儀( 上海秉越 電子儀器有限公司) 。

3 動物

健康 Wistar 大鼠，12 只，雌雄各半，體重( 200 ± 20) g，新疆醫科大學實驗動物中心，合 格 證 號: SYXK( 新) 2016-0004。

4 對照品溶液配制

精密稱取 DH-004 10． 20 mg( 實際稱量) ，置于 10 mL 棕色量瓶中，加入甲醇使藥物溶解并定容制 成 1． 02 mg·mL － 1的儲備液; 精密吸取適量，用甲醇 稀釋成 0． 051，0． 102，0． 51，1． 02，2． 55 和 5． 1 μg· mL － 1的系列標準溶液，置于 4 ℃ 冰箱冷藏備用。精 密稱取替硝唑 10． 20 mg，置于 10 mL 棕色量瓶中， 加甲醇使藥物溶解并定容制成 1. 02 mg·mL － 1的儲 備液; 用甲醇稀釋，配制成 8. 16 μg·mL － 1 的內 標 溶液。

5 色譜/質譜條件

色譜柱: Acquity Uplc BEH C18色譜柱( 50 mm × 2． 1 mm，1． 7 μm) ; 流動相 A 為乙腈，流動相 B 為 0. 1% 甲酸，梯度洗脫: 0 ～ 0． 5 min，9% ～ 11% A; 0. 5 ～ 2． 51 min，11%A; 2． 51 ～ 4． 0 min，11% ～ 15． 5% A; 4. 0 ～ 5． 0 min，15． 5% ～ 90% A; 5． 0 ～ 5． 1 min，90% ～ 50% A; 5． 1 ～ 6． 0 min，50% A; 6． 0 ～ 8． 0 min，50% ～ 9% A; 8． 0 ～ 10． 0 min，9% A; 柱溫: 30 ℃ ; 流速: 0． 4 mL·min － 1 ; 進樣量: 5 μL。離子源: ESI; 離子檢測方 式: MＲM; 離子極性: 正離子; 錐孔電壓: 15 V; 毛細 管電壓: 0． 8 KV; 離子源溫度: 124 ℃ ; DH-004 m / z 331． 1，替硝唑 m / z 81． 0。

6 實驗動物分組

Wistar 大鼠 12 只，雌雄各半，隨機分為 2 組: 灌胃( ig) 給藥組、靜脈注射( iv) 給藥組，每組 6 只。 ig 給藥組給予 0． 5% 羧甲基纖維素鈉水溶液配置 的 DH-004 混懸 液( 50 mg·kg － 1 ) ; iv 給藥 組 給 予 2% 乙醇和生理鹽水配制的 DH-004 混 懸 液( 10 mg·kg － 1 ) 。

7 給藥及血樣采集

將大鼠禁食不禁水 12 h，按照相應劑量分別 ig 及尾 iv 給藥。ig 給藥組于給藥前及給藥后 0. 25， 0. 5，0． 75，1，2，4，6，8，12 和 24 h 眼底靜脈叢采血 ( 0． 3 ～ 0． 4) mL; iv 給藥組于給藥前及給藥后 0. 17，0． 33，0． 5，0． 75，1，2，4，6，8 和 12 h 眼底靜脈叢采血 ( 0． 3 ～ 0． 4 ) mL，置肝素鈉抗凝離心管中，3 500 r·min － 1離心 15 min，血漿置 － 20 ℃冰箱保存。

8 血漿樣品處理

取 1． 5 mL 離心管，加入內標溶液20 μL，氮氣吹 干，加入血漿樣品 100 μL，超聲 5 min，渦旋 30 s，加 入 200 μL 乙腈，渦旋震蕩 3 min，12 000 r·min － 1離心 10 min，上清液進樣檢測。 9 數據處理 將樣品峰面積與內標峰面積比值代入標準曲線 方程，求得不同時間點的血藥濃度。以平均血藥濃 度-時間作圖，得到 DH-004 的血藥濃度-時間利用 Kinetica 5． 0 藥動學軟件進行非房室模型分析， 得到主要藥動學參數，比較 DH-004 不同給藥途徑 在大鼠體內藥動學行為差異。

結 果

1 專屬性

取空白血漿、空白血漿加標準溶液、大鼠血漿樣 品，均按“8”項下方法處理，色譜圖見圖 1，DH-004 和內標的保留時間分別為 1． 7 和 5． 1 min，峰形良 好，大鼠血漿中內源性物質不干擾 DH-004 和內標 的測定，方法專屬性良好。

2 標準曲線

精密吸取 DH-004 系列標準溶液和內標溶液各 20 μL，氮氣吹干，加入大鼠空白血漿 100 μL，按照 “8”項 下 方 法 操 作，配 制 相 當 于 DH-004 濃 度 為 10. 2，51，102，255，510 和 1 020 ng·mL － 1 的血漿樣 品，進樣分析。以 DH-004 濃度為橫坐標，DH-004 峰面積與內標峰面積比值為縱坐標，進行線性回歸， 得到 DH-004 的標準曲線方程為: Y = 0. 003 3X － 0. 003 7( r = 0. 999 8) 。結果表明，DH-004 在 10. 2 ～ 1 020 ng·mL － 1 濃度范圍內線性關系良好。定量下限為 10. 2 ng·mL － 1。

3 精密度

精密吸取 DH-004 對照品儲備液，用甲醇稀釋 成質量濃度分別為 0. 102，1. 02 和 4. 08 μg·mL － 1的 質控標準溶液。按照“2”項下方法配制成低、中、高 ( 濃度 20． 4，204 和 816 ng·mL － 1 ) 的質控樣品，每個 濃度 5 份，按“8”項下方法處理后測定。同法制備 3 批，計算第 1 批批內精密度和 3 批之間的批間精密 度。結果表明，DH-004 質控低、中、高濃度批內、批間 ＲSD 均 ＜ 15%，符合生物樣品檢測要求。

討 論

非房室模型法不依賴于任何房室模型假設，能 夠較客觀地描述藥物的體內暴露和動力學行為，廣 泛應用于新藥的藥動學與生物等效性評價。本 實驗應用 Kinetica 5． 0 藥動學軟件對 DH-004 大鼠 血漿藥物濃度和時間進行擬合。結果發現 DH-004 藥時曲線呈雙峰現象，房室模型模擬較復雜。因此， 選用非房室模型作為本實驗擬和方法。