不同方法測(cè)定舒腦欣滴丸中藁本內(nèi)酯含量的比較

舒腦欣滴丸由川芎和當(dāng)歸兩味藥材提取加工制 成，具有理氣活血、化瘀止痛的功效。臨床上常 用于治療血虛血淤引起的頭痛、頭暈、偏頭痛、視物 昏花、健忘及失眠等癥狀，療效較為顯著。而藁 本內(nèi)酯是其主要活性成分之一，藥理研究表明，藁本 內(nèi)酯具有保護(hù)腦神經(jīng)、改善微循環(huán)、舒張血管、抑制 血管平滑肌細(xì)胞增殖、抗癌、抗微生物、解熱、鎮(zhèn)痛消 炎等藥理作用。目前，藁本內(nèi)酯的含量測(cè)定方法 多采用高效液相色譜法，因藁本內(nèi)酯為揮發(fā)油成 分，也有氣相色譜法測(cè)定。本次實(shí)驗(yàn)建立了舒腦欣 滴丸藁本內(nèi)酯的液相測(cè)定方法和氣相測(cè)定方法，比 較不同測(cè)定方法對(duì)舒腦欣滴丸中藁本內(nèi)酯含量測(cè)定 結(jié)果的影響。

GC-2014C 氣相色譜儀( 日本島津儀器有限公 司) ; HV-3 靜音無油空壓機(jī)( 濟(jì)南浩偉實(shí)驗(yàn)儀器有 限公司) ; 純水氫氣發(fā)生器( 濟(jì)南浩偉實(shí)驗(yàn)儀器有限 公司) ; Waters e2695 型高效液相色譜儀( 美國 Waters 公 司) ; 2998 PDA Detector 紫 外 檢 測(cè) 器; KQ250DB 型數(shù)控超聲波清洗器( 昆山市超聲儀器有限 公司) ; 電子天平( 德國賽多利斯) 。

舒腦欣滴丸( 天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公 司，批號(hào): 676018) ; 藁本內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品( 實(shí)驗(yàn)室自制) ; 微孔濾膜( 孔徑 0. 45 μm) ; 甲醇( 色譜純，天津市凱 通化學(xué)試劑有限公司) ; 乙酸( 分析純，天津市凱通 化學(xué)試劑有限公司) ; 純凈水。

GC-2014C 氣相色譜儀，色譜柱: KB-624 毛細(xì)管柱( 30 m × 0. 32 mm × 1. 80 mm) ，檢 測(cè)器: 氫焰離子化檢測(cè)器( FID) ，進(jìn)樣口溫度 220℃， 檢測(cè)器溫度 320℃，色譜柱溫度 220℃，載氣為氮?dú)猓?進(jìn)樣量為 1 μL。

精密稱量藁本內(nèi)酯對(duì) 照品 5. 6 mg 于 25 mL 容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，搖勻，制成濃度為 200 μg·mL － 1 的藁本內(nèi)酯溶 液，避光冷保存。

取舒腦欣滴丸 5 粒，粉 碎，精密稱重，置具塞錐形瓶中，精密加入 70% 的甲 醇 10 mL，稱量，超聲處理 30 min，冷卻，再次稱定其 重量，用甲醇補(bǔ)足失重，0. 45 μm 微膜濾過，精密量 取其續(xù)濾液 1 mL 置于 10 mL 容量瓶中，加入 70% 甲醇稀釋至刻度，晃勻，即得。

分別取空白溶液、對(duì)照品 溶液、供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣分析，記錄 色譜圖，見圖 1。從色譜圖中可以看出，對(duì)照品溶液 中藁本內(nèi)酯的保留時(shí)間為 8. 6 min。供試品溶液主 峰的保留時(shí)間與對(duì)照品溶液的主峰保留時(shí)間一致， 與相鄰組分分離較好，無相互干擾。

2. 1. 5 線性關(guān)系考察

精密量取藁本內(nèi)酯對(duì)照品 母液 0. 5、1. 0、1. 5、2. 0、2. 5 mL 置 10 ml 棕色容量 瓶中，用甲醇稀釋至刻度，晃勻，得一系列不同濃度 的藁本內(nèi)酯對(duì)照品溶液，按“2. 1. 1”項(xiàng)下色譜條件 進(jìn)樣 3 次，取平均值，以峰面積對(duì)濃度作線性回歸， 得回歸方程為: Y = 302. 7X + 392. 4，r = 0. 9993，結(jié) 果表明，藁本內(nèi)酯在 10 ～ 50 μg·mL － 1 范圍內(nèi)線性 關(guān)系良好。

取對(duì)照品溶液按 “2. 1. 1”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣量為 1 μL，重復(fù)進(jìn)樣 5 次，記錄色譜圖，以藁本內(nèi)酯的峰面積計(jì)算藁本內(nèi)酯 的 ＲSD 為 1. 74% ，表明該方法的精密度良好。 取供試品溶液分別于 0，2，4，6，8，10 h 按 “2. 1. 1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，以藁本內(nèi)酯的峰 面積計(jì)算 ＲSD 為 0. 50% ，表明供試品溶液在 10 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

取同一批號(hào)舒腦欣滴丸 5 份， 按照“2. 1. 3”項(xiàng)下方法制備供試品溶 液 5 份，按 “2. 1. 1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算藁本內(nèi)酯的 峰面積 ＲSD 為 1. 86% ，表明重復(fù)性良好。

精密量取“2. 1. 3”項(xiàng)下 已知濃度的供試品溶液 6 份，各加入對(duì)照品適量，用 甲醇溶液稀釋至刻度，晃勻，按上述色譜條件進(jìn)樣 1μL，每份進(jìn)樣 3 次，以藁本內(nèi)酯峰面積計(jì)算藁本內(nèi) 酯的平均回收率為 101. 32% ，ＲSD 為 1. 29% 。

取 3 個(gè)不同批次的舒腦欣 滴丸樣品，按“2. 1. 3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并 按照“2. 1. 1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算舒腦欣 滴丸中藁本內(nèi)酯平均含量為 876. 70 μg /丸。

Waters e2695 高效液相色譜儀， 2998 PDA Detector 紫外檢測(cè)器，Venusil MP C18 色 譜柱( 4. 6 mm × 250 mm，5 μm) ，流動(dòng)相為甲醇0. 2% 冰醋酸水溶液( 75∶ 25) ，檢測(cè)波長(zhǎng)為 325 nm 流速為 1. 0 mL /min，進(jìn)樣量 10 μL，柱溫 30℃。

取制備的藁本內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn) 品 2. 5 mg，置于 25 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并定 容至刻度，搖勻后即制成濃度為 100 μg /mL 的標(biāo)準(zhǔn) 品貯備溶液，避光冷藏保存。

取“2. 1. 3”項(xiàng)下供試品 溶液即得。

分別取空白溶液、對(duì)照品 溶液、供試品溶液，按“2. 2. 1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣 10 μL 測(cè)定。色譜圖如圖 2 所示，從圖中可以看出藁本 內(nèi)酯在 9. 9 min 出峰，色譜峰峰型良好，且各組分之 間互不干擾測(cè)定。

2. 2. 5 線性關(guān)系考察

精密量取對(duì)照品溶液適量， 置 10 mL 棕色容量瓶中，用甲醇溶液稀釋至刻度，制 成 5、10、20、40、50 μg·mL － 1 的 5 個(gè)不同濃度，取系 列不同對(duì)照品溶液 10 μL 按“2. 2. 1”項(xiàng)下色譜條件 分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，以藁本內(nèi)酯的峰面積對(duì)其濃 度進(jìn)行 線 性 回 歸，得 回 歸 方 程 為: Y = 19525X + 55814( r = 0. 9997) ，表明藁本內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品濃度在 5 ～ 50 μg·mL － 1 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

取制備好的供試品 溶液 5 份，按“2. 2. 1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄 峰面 積，并 計(jì) 算 ＲSD 值，結(jié) 果 藁 本 內(nèi) 酯 ＲSD 為 1. 04% ，表明該方法精密度良好。 取“2. 2. 3”項(xiàng)下供試品溶液，分別于 0、2、4、8、 10 h 進(jìn)樣測(cè)定，按上述色譜條件進(jìn)樣 10 μL 測(cè)定，并 計(jì)算藁本內(nèi)酯的 ＲSD 為 1. 25% ，表明樣品溶液在 10 h 內(nèi)穩(wěn)定。

取同一批次的舒腦欣滴丸藥 品 5 份，按“2． 2． 3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液 5 份， 在“2. 2. 1”項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣 10 μL，記錄下峰面 積，并計(jì)算 ＲSD 值為 1. 53% ，表明該法重復(fù)性良好。

取已知含量的供試品溶 液 3 mL，6 份，置 10 mL 容量瓶中，分別加入對(duì)照品 50 μg，用甲醇稀釋至刻度，晃勻，按“2. 2. 1”項(xiàng)下色 譜條件進(jìn)行測(cè)定，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算藁本內(nèi)酯含量， 算出平均回收率為 99. 7% ，ＲSD 為 0. 6% 。

按“2. 2. 3”項(xiàng)條件下制備供試 品溶液 3 份，每份各進(jìn)樣 3 次，記錄色譜圖，求得舒 腦欣滴丸中藁本內(nèi)酯的含量為 887. 16 μg /丸。 2. 3 F 檢驗(yàn) 照上述供試品溶液制備方法制備舒腦欣滴丸樣 品溶液 5 份，各吸取 1 μL 按“2. 1. 1”項(xiàng)下色譜條件 測(cè)定，各吸取 10 μL 按“2. 2. 1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定， 統(tǒng)計(jì)各方法測(cè)定項(xiàng)下藁本內(nèi)酯峰面積，計(jì)算含量，利 用 F 檢驗(yàn)分析兩組數(shù)據(jù)之間的差異性，判斷其差異 有無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 查閱可知 F = S12 /S22 ( S1 ＞ S2) ，用實(shí)驗(yàn)測(cè)得的 兩種含量數(shù)據(jù)方差代入 F 檢驗(yàn)公式中，計(jì)算方差 比: F = 2. 99。F ＜ F0. 05，4，4 = 6. 39，結(jié)果表明，兩組數(shù)據(jù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

本次實(shí)驗(yàn)建立了氣相色譜法測(cè)定舒腦欣滴丸中藁本內(nèi)酯含量，對(duì)氣相色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，考察了檢 測(cè)器溫度 250℃、280℃、320℃，色譜柱溫度 200℃、 210℃、220℃，結(jié)果發(fā)現(xiàn)溫度對(duì)蒿本內(nèi)酯影響很大， 提高檢測(cè)器溫度和色譜柱溫度，藁本內(nèi)酯峰與相鄰 組分分離較好，達(dá)到基線分離，而且出峰時(shí)間適中， 峰型良好; 隨著溫度的升高，色譜峰會(huì)有所提前，節(jié) 省了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，故檢測(cè)器溫度是 320℃，色譜柱溫度 220℃。同時(shí)也建立了高效液相色譜法測(cè)定藁本內(nèi) 酯含 量，查閱文獻(xiàn)進(jìn)行了流動(dòng)相優(yōu)化，考 察 了 0. 1% 、0. 2% 、1% 冰醋酸溶液，同時(shí)也對(duì)流動(dòng)相的比 例進(jìn)行了調(diào)整，適當(dāng)?shù)奶岣吡擞袡C(jī)相比例，使其出峰 快速，節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間，并且根據(jù)分離效果、峰形效果， 最終選擇甲醇︰ 0. 2% 冰醋酸水溶液( 75 ︰ 25) 。 利用 F 檢驗(yàn)對(duì)兩種方法測(cè)定的含量結(jié)果進(jìn)行 了檢驗(yàn)，其結(jié)果并無顯著性差異，表明兩種方法均可 作為舒腦欣滴丸中藁本內(nèi)酯含量測(cè)定的方法，均能準(zhǔn)確地測(cè)定出其含量，但液相在實(shí)際操作過程中較 之氣相分析時(shí)間稍長(zhǎng)。